องค์ประกอบใดไม่จำเป็นต่อการเกิดปฏิกิริยาในหลอดทดลองของเทคนิค pcr

เทคนิคพีซีอาร์ (PCR)  

เทคนิคพีซีอาร์ (PCR)  มีชื่อเต็มว่าเทคนิคปฏิกิริยาลูกโซ่โพลิเมอเรส (Polymerase Chain Reaction)  เป็นเทคนิคเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมคือดีเอ็นเอ  ให้มีปริมาณมากเป็นล้านเท่า ในระยะเวลาอันรวดเร็ว โดยอาศัยหลักการจำลองตัวของสายดีเอ็นเอ (DNA Replication) เลียนแบบกระบวนการสังเคราะห์ดีเอ็นเอในสิ่งมีชีวิตตามธรรมชาติ ที่มีการสร้างสายดีเอ็นเอสายใหม่อีกหนึ่งสายจากดีเอ็นเอเดิม

หลักการทำงานของเทคนิคพีซีอาร์ 

เทคนิคนี้ใช้หลักการพื้นฐานในการเพิ่มดีเอ็นเอด้วยการจำลองดีเอ็นเอสายใหม่จากสายดีเอ็นเอที่เป็นต้นแบบหนึ่งสาย ด้วยเอนไซม์ดีเอ็นเอโพลีเมอเรส (DNA polymerase)  โดยใช้ดีเอ็นเอเริ่มต้นหรือไพรเมอร์ (Primer) 1 คู่ ทำให้สังเคราะห์ดีเอ็นเอได้คราวละ 2 สายพร้อมกัน ประกอบด้วยปฏิกิริยาสำคัญ 3 ขั้นตอน และหมุนเวียนต่อเนื่องกันไป ภายใต้สภาวะที่เหมาะสมของแต่ละขั้นตอน

1. การแยกสายดีเอ็นเอเกลียวคู่ออกจากกัน (Denaturation) ใช้อุณหภูมิ ประมาณ 94 องศาเซลเซียส เมื่อเริ่มต้นดีเอ็นเอแม่แบบ จะอยู่ในลักษณะที่เป็นเกลียวคู่ เมื่อเพิ่มอุณหภูมิถึงประมาณ 94 องศาเซลเซียส จะทำให้พันธะไฮโดรเจนระหว่างคู่เบสของดีเอ็นเอถูกทำลาย ทำให้เส้นดีเอ็นเอแยกออกจากกัน โดยขั้นตอนนี้จะแตกต่างจากการสังเคราะห์ดีเอ็นเอในธรรมชาติ คือ ในสิ่งมีชีวิติจะมีเอนไซม์เฮลิเคส(Helicase) ช่วยในการแยกสายและคลายเกลียวดีเอ็นเอ
2. การจับของไพร์เมอร์กับดีเอ็นเอแม่แบบ (Annealing) ใช้อุณหภูมิประมาณ 40-62 องศาเซลเซียส เมื่อแยกสายดีเอ็นเอออกจากกันแล้ว จะลดอุณหภูมิลงเหลือ 40-62 องศาเซลเซียส เพื่อให้ดีเอ็นเอสังเคราะห์ขนาดสั้นประมาณ 15-25 เบส ที่เรียกว่าไพร์เมอร์ (Primer) เข้ามาจับบริเวณที่มีลำดับเบสคู่สมกัน ในการสังเคราะห์ดีเอ็นเอ ไม่สามารถที่จะเริ่มจากศูนย์ได้เนื่องจากเอ็นไซม์ดีเอ็นเอพอลิเมอร์เรส (DNA polymerase) ต้องการปลาย-OH ทางด้าน 3’เพื่อนำ นิวคลีโอไทด์ตัวต่อมาต่อ ซึ่งในสิ่งมีชีวิตจะมีเอ็นไซม์ที่มีชื่อว่า ไพรเมส (Primase) เป็นตัวสร้างอาร์เอ็นเอไพรเมอร์ขึ้น
3. การสังเคราะห์ดีเอ็นเอสายใหม่ต่อจากไพรเมอร์ (Extension) ใช้อุณหภูมิ ประมาณ 68-72 องศาเซลเซียส ในขั้นตอนนี้จะเป็นการสร้างสายดีเอ็นเอต่อจากไพร์เมอร์ โดยอุณหภูมิที่ใช้จะพอเหมาะกับ การทำงานของ Taq DNA polymerase

จากขั้นตอนที่ 1-3 ซึ่งนับเป็นจำนวน 1 รอบ (One cycle) ให้ผลผลิตเป็นดีเอ็นเอสายคู่ที่มีลำดับเบสเป็นคู่สม (หรือเข้ากัน) กับดีเอ็นเอที่เป็นต้นแบบ เพิ่มขึ้นเป็นสองเท่า และเมื่อจัดให้เกิดปฏิกิริยาลูกโซ่จากขั้นที่ 1 ถึง 3 หมุนเวียนไปอีกหลาย ๆ รอบ จะเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอได้จำนวนมาก ประมาณว่าปฏิกิริยา 30 – 40 รอบ สามารถเพิ่มปริมาณสารดีเอ็นเอได้ไม่น้อยกว่าพันล้านเท่า  ดังนั้น แม้ตัวอย่างที่นำมาศึกษามีปริมาณสารพันธุกรรมน้อยมาก เราก็ใช้เทคนิคพีซีอาร์เพิ่มจำนวนได้หลายเท่าทวีคูณ

ดีเอ็นเอที่เกิดจากเทคนิคนี้ในหลอดทลอง มองไม่เห็นด้วยตาเปล่า  ดังนั้นเพื่อตรวจหาดีเอ็นเอผลผลิต ต้องนำตัวอย่างที่ทำพีซีอาร์มแยกหาดีเอ็นเอโดยใช้เทคนิคที่เรียกว่าอะกาโรสเจลอิเล็กโตรโฟริสิส (Agarose gel electrophoresis) ซึ่งเป็นการแยกดีเอ็นเอด้วยกระแสไฟฟ้าบนแผ่นวุ้น (Agarose gel) โดยระยะทางที่ดีเอ็นเอเคลื่อนที่ไปได้ขึ้นกับขนาดของดีเอ็นเอและกระแสไฟฟ้าที่ใช้ ดีเอ็นเอที่แยกโดยวิธีนี้ มองเห็นได้เมื่อย้อมด้วยสีพิเศษ ซึ่งเรืองแสงภายใต้แสงอุลตร้าไวโอเลต

ประโยชน์ของ PCR ในการตรวจวินิจฉัยโรค

PCR เป็นเทคนิคสำคัญมากในงานอณูชีวโมเลกุล ทั้งในส่วนที่เป็นงานพื้นฐานในห้องปฏิบัติการ ตลอดจนการประยุกต์ใช้ทางการแพทย์ และการเกษตรสามารถใช้ในการวินิจฉัยโรคต่าง ๆ ทั้งโรคติดเชื้อและโรคจากพันธุกรรม ศึกษาความผันแปรทางพันธุกรรม ศึกษากลายพันธุ์ของยีน ทำแผนที่ยีน และศึกษาลำดับเบสของยีนของสิ่งมีชีวิตได้ทุกชนิด โดยสามารถสรุปได้ตามหัวข้อต่าง ๆ ดังต่อไปนี้

ข้อสอบ

1. หลักการของเทคนิคพีซีอาร์ ใช้ความรู้เกี่ยวกับกระบวนการใดของสิ่งมีชีวิต

ก.กระบวนการสังเคราะห์แสง

ข.กระบวนการสังเคราะห์อาร์เอ็นเอ

ค.กระบวนการสังเคราะห์ดีเอ็นเอ

ง.กระบวนการสังเคราะห์โปรตีน

2. ความแตกต่างของเทคนิคโคลนนิ่ง(Cloning) กับ เทคนิคพีซีอาร์ (PCR) คือ

ก.โคลนนิ่งเป็นเทคนิคในการสร้างสารพันธุกรรมที่เหมือนกันในหลอดทดลอง แต่พีซีอาร์เป็นการสร้างดีเอ็นเอจำนวนเพิ่มขึ้น

ข.โคลนนิ่งเป็นเทคนิคการเพิ่มจำนวนดีเอ็นเอในสิ่งมีชีวิต แต่พีซีอาร์เป็นการเพิ่มจำนวนดีเอ็นเอในหลอดทดลอง

ค.โคลนนิ่งไม่ต้องใช้เอนไซม์ในการเพิ่มจำนวน แต่พีซีอาร์ต้องใช้เอนไซม์ DNA polymerase ในการเพิ่มจำนวน

ง.ถูกทุกข้อ

เฉลย

1.ค

2.ข

{ cr https://sites.google.com/site/biology2012science/what-is-dna/thekhnikh-pcr-ni-kar-pheim-canwn-dna }